Jag vill börja med en påminnelse som ofta glöms bort i offentliga diskussioner: Covid mRNA-vaccinerna är genuint nya medicinska produkter.
Före nödgodkännandena 2020 hade mRNA-vaccinteknik aldrig använts i stor skala på människor. Endast två kliniska prövningar, en från Pfizer-BioNTech och en från Moderna, hade någonsin testat denna plattform på människor. Sammanlagt hade ungefär 37 000 individer någonsin fått ett mRNA-vaccin i medicinens historia (exklusive tidigare erfarenheter med rabies-, CMV- och cancervacciner som begränsades till mycket mindre tidiga studier). Det är inte en kritik; det är helt enkelt ett konstaterande av fakta. Men det betyder att den långsiktiga säkerhetsprofilen för dessa produkter var, och förblir, ofullständigt förstådd.
Det som följer är bekant för nästan alla molekylärbiologer. Det är komplicerat men jag försöker förenkla det med tanke på vad som står på spel. Det är viktigt att tydligt lägga fram det molekylära ramverket för alla eftersom hur dessa vacciner tillverkas direkt avgör vad som finns inuti flaskan.. Och det som finns inuti injektionsflaskan, när den väl injicerats, kommer att färdas genom kroppen och aktivera en kaskad av händelser som kan leda till långsiktiga hälsokonsekvenser.
In vitro-transkription är inte bara en tillverkningsdetalj
Modifierade mRNA-vacciner framställs med hjälp av en process som kallas in vitro-transkription (IVT))IVT är den metod som används för att syntetisera det modifierade mRNA som slutligen blir den aktiva ingrediensen i vaccinet.
Detta är ingen trivial teknikalitet. IVT formar i grunden den molekylära sammansättningen av slutprodukten.
Forskare vid BioNTech, inklusive de som är direkt involverade i utvecklingen av Pfizer-vaccinet, har publicerat en detaljerad granskning1 som beskriver hur IVT-reaktioner genererar inte bara det avsedda fullängds-mRNA:t, utan även en rad biprodukter och föroreningar, hur dessa vanligtvis avlägsnas och vilka deras biologiska konsekvenser kan bli om de kvarstår. Dessa tillverkningsanvisningar tillsammans med de biprodukter de skapar beskrevs också i detalj av Moderna i deras patent (US10 653 712 B2 och US10 077 439 B2). Men ännu viktigare är att denna molekylärbiologi var väl etablerad långt före Covid. Inget av detta är spekulativt.
Utgångsmaterialet: DNA-mallar
I grund och botten börjar en IVT-reaktion med dubbelsträngat DNA som kodar för det önskade proteinet. I detta fall SARS-CoV-2-spikeproteinet.
Den spikkodande sekvensen som används i mRNA-vacciner är genetiskt modifierade för att förbättra stabilitet och cellulär tolerans, inklusive två aminosyrasubstitutioner som gör den distinkt från den virala spiken. Den modifieringen är avsiktliga.
Själva DNA-mallen kan anta olika former. Under Pfizers tidiga kliniska prövningar användes PCR-genererade DNA-fragment. Den kommersiella tillverkningsprocessen förlitade sig dock på DNA härlett från plasmider. Detta är viktigt eftersom plasmider innehåller ytterligare regulatoriska sekvenser. I Pfizers fall inkluderar dessa element som SV40-promotor och ori-sekvenser, vilket ger upphov till oro om de skulle komma in i mänskliga celler.
När denna DNA-mall har lagts till IVT-reaktionen, tillsammans med RNA-polymeras och andra komponenter, transkriberas den till mRNA (figur 1).
IVT producerar biprodukter genom designMedan den önskade utsignalen från IVT är den avsedda fullängds-mRNA-produkten, är den faktiska utsignalen mer komplex. Dessa inkluderar olika biprodukter i form av (1) olika RNA-arter inklusive dubbelsträngat RNA (dsRNA), (2) DNA fäst vid RNA (RNA-DNA-hybrider), och (3) det fria DNA:t från den ursprungliga mallen (Figur 2).
Bildningen av dessa biprodukter är väl dokumenterad och oundviklig och det är därför nedströms rening är absolut nödvändig för säkerheten.
Figur 2. Biprodukter och föroreningar från IVT-tillverkning. Bild anpassad från 1.Rening har kända begränsningar
Efter tillverkningen behövs två reningssteg för att först ta bort DNA:t och sedan ta bort RNA-biprodukterna (Figur 3):
Figur 3. Borttagning av IVT-biprodukter. Bilden är anpassad från 2.För att avlägsna DNA:t tillsätts ett enzym till reaktionsblandningen som kallas DNase I, vilket vanligtvis används för att bryta ner förorenande DNA. Även om DNase I är effektivt mot fritt mall-DNA, visar flera studier, inklusive arbete av BioNTech-forskare själva, att DNase I är ineffektivt på att avlägsna DNA som är fäst vid RNA (RNA-DNA-hybrider).
Denna begränsning är inte kontroversiell. Den är dokumenterad i litteraturen.
Vad oberoende analyser har visat
Detta sammanhang är avgörande för att tolka nyligen genomförda oberoende analyser av färdiga vaccinflaskor.
Forskare3 och regulatorer4 har rapporterat att de har detekterat DNA-föroreningar i i stort sett varje testad ampull. Dessa föroreningar inkluderade både dubbelsträngat DNA och RNA-DNA-hybrider som verkade resistenta mot DNase I-digerering.
I vissa prover fanns spikkodande DNA i nivåer mer än 100 gånger högre än andra plasmidsekvenser.5, vilket tyder på ojämn eller ofullständig matsmältning. Sekvensering och kvantitativa PCR-analyser detekterade vidare DNA-fragment med en genomsnittlig längd på ~200 baspar, varav vissa översteg 4 kilobaser. I flera fall observerades sekvenser som sträckte sig över nästan hela plasmiden.
Sammantaget väcker dessa fynd allvarliga frågor om reningens konsekvens och fullständighet under storskalig tillverkning, och om de potentiella biologiska konsekvenserna av kvarvarande nukleinsyror hos människor.
Varför nukleinsyraföroreningar är biologiskt viktiga
RNA och DNA är potenta aktivatorer av medfödda immunförsvarsvägar. Detta är inte spekulativt. Mönsterigenkänningsreceptorer och cGAS-STING-vägen reagerar kraftigt på främmande nukleinsyror, vilket utlöser inflammation, tillväxthämning och till och med celldöd.
Dessa mekanismer är just anledningen till att genterapiprodukter är föremål för strikt säkerhetsövervakning.
Ironiskt nog utformades Covid mRNA-vaccinerna med modifieringar specifikt för att minska denna potenta medfödda immunaktivering. Men RNA-DNA-hybrider och DNA-fragment kommer fortfarande att framkalla starka immunsvar trots dessa modifieringar.
Uthållighet väcker nya frågor
Det finns nu betydande bevis som visar att spike-mRNA och -protein finns kvar i mänskliga vävnader i veckor, månader och till och med år efter vaccination (tabell 1).
Vi vet ännu inte om denna ihållighet återspeglar förlängd mRNA-stabilitet, fortsatt translation eller DNA-baserade mekanismer. Men med tanke på rimligheten av DNA-integration och långlivat icke-integrerat plasmid-DNA i muskelceller,6 Det är inte orimligt att anta att kvarvarande Spike mRNA, protein och antikroppar mot Spike år efter vaccination inte är relaterat till DNA-föroreningar och biprodukter efter IVT.
Tabell 1. Spik-mRNA och proteinpersistens efter vaccination hos människorKortsiktiga och långsiktiga säkerhetskonsekvenser
Sammantaget väcker dessa uppgifter flera viktiga säkerhetsaspekter.
För det första har akuta immunreaktioner, inklusive cytokinstormar och anafylaxi, rapporterats omedelbart efter vaccination. Sådana starka inflammatoriska reaktioner bör inte avfärdas direkt som orelaterade till föroreningar, särskilt med tanke på vad som är känt om nukleinsyrainducerad immunaktivering.
För det andra, och mer kritiskt, finns det långsiktiga risker. Ihållande spikuttryck skulle rimligen kunna bidra till kroniska immunsyndrom. Ännu mer oroande är möjligheten till DNA-integration, vilket medför risker för insertionsmutagenes eller genstörning. Detta innebär en risk för cancer eller utvecklingsdefekter beroende på var och vid vilken ålder DNA:t integrerades.
Det är värt att notera att FDA självt anger i sina informationsblad att dessa vacciner inte har har utvärderats med avseende på cancerframkallande egenskaper (cancerbildning) eller genotoxicitet (DNA-skada), en punkt som skulle vara rutinmässig och förväntad vid tillsyn av genterapi, där långsiktig övervakning är standard.
Regelklyftan kring DNA i mRNA-vacciner
Eftersom det egentligen inte längre råder någon tvist om att det finns kvarvarande DNA i mRNA-vacciner, är frågan om nuvarande riktlinjer och säkerhetsgränser är lämpliga för mRNA-vacciner. Vi har försäkrats om att DNA-biprodukterna ligger inom de gränser som anges i de regulatoriska riktlinjerna. Så vad är FDA:s riktlinjer kring DNA-biprodukter och föroreningar?
Den vanligast citerade FDA-vägledningen om rest-DNA (≤10 ng per dos) utvecklades för virusvacciner som produceras i levande celler som är fragmenterade och "nakna", med begränsad förmåga att komma in i mänskliga celler. mRNA-vacciner produceras dock inte i celler, deras rest-DNA härrör inte från värdceller, och viktigast av allt, DNA:t i mRNA-vaccinerna är inte naket. Det är associerat med LNP-leveranssystem, vilket specifikt gör det mycket enkelt för DNA att komma in i celler. FDA:s vägledning från 2010 är tydlig med att den inte fastställer en relevant säkerhetströskel för DNA associerat med LNP-baserade produkter.
Den andra vanligt citerade vägledningen är från WHO för rekombinanta proteinterapier som behandlar rest-DNA i produkter såsom monoklonala antikroppar eller hormoner som produceras i modifierade celler. Även här kommer rest-DNA från värdceller eller expressionsplasmider, finns som spår av icke-inkapslat DNA (naket), och slutprodukten är ett renat protein, inte en nukleinsyrabaserad terapi (mRNA-vaccin). Så denna vägledning gäller inte mRNA-vacciner.
Varken FDA:s eller WHO:s regelstandarder som oftast citeras för rest-DNA var utvecklade för mRNA-vacciner, och tar inte direkt itu med denna säkerhetsfråga.
Vad WHO sa om mRNA-vacciner – efter implementeringen
År 2022 utfärdade Världshälsoorganisationen riktlinjer specifikt riktade mot mRNA-vacciner7Det är värt att notera att detta dokument släpptes efter den globala utrullningen av dessa produkter. Det anges specifikt att denna vägledning var ett svar på: ”säkerhets-, produktions- och regelfrågorna i samband med denna nya teknik.Dokumentet innehåller också flera viktiga uttalanden:
"Eftersom detaljerad information ännu inte finns tillgänglig om de metoder som används för produktion, kontrollerna ännu inte är standardiserade för säkra och effektiva mRNA-vacciner, och vissa detaljer förblir patentskyddade och därmed inte allmänt tillgängliga, är det inte genomförbart att utveckla specifika internationella riktlinjer eller rekommendationer i nuläget."
Det står vidare: ”De detaljerade produktions- och kontrollförfarandena…bör diskuteras med och godkännas av NRA [Nationell tillsynsmyndighet]] från fall till fall."
WHO erkänner att kontrollerna för mRNA-vacciner ännu inte standardiserades och att det inte var möjligt att fastställa specifika internationella riktlinjer eller rekommendationer. Dessutom krävs tillsyn för att nationella myndigheter ska kunna utvärdera varje enskilt fall.
Detta meddelades efter att mRNA-vaccinerna hade distribuerats.
Och i skrivande stund har FDA fortfarande inte fastställt standardiserade riktlinjer för mRNA-vacciner och tillhandahållit några bevis och säkerhetsbaserade data som stöder eventuella begränsningar av DNA i mRNA-vacciner.
Slutligen bör det upprepas: även om mRNA-tekniken inte är ny, reglerades den före covid som genterapi, inte som ett traditionellt vaccin. Säkerhetsproblemen kring DNA-biprodukterna i covidvacciner kommer att vara desamma för alla mRNA-vacciner, inklusive de för influensa, RSV eller till och med mRNA-vacciner för cancer.
Detta beror på att mRNA-produkter är fundamentalt annorlunda. De måste komma in i cellerna och instruera dem att producera ett främmande protein. Detta skiljer sig från andra konventionella vacciner som levererar proteinet direkt. Det finns inget kliniskt prejudikat för denna plattform, och det finns inget kliniskt prejudikat för upprepad dosering. Och definitivt inget prejudikat på populationsnivå.
I detta skede, utan pandemi, med ackumulerade mekanistiska data och kliniska observationer, och spridningen av mRNA-vaccinprodukter som kommer ut på marknaden, behöver vi transparens och direkt engagemang i seriösa säkerhetsstudier från tillsynsmyndigheter, särskilt FDA, som fastställer viktiga riktlinjer för tillverkning av dessa produkter – särskilt när det gäller DNA-biprodukter.
Ny teknologi kräver ny granskning – inte tystnad, gaslighting eller censur.
Referensprojekt
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al. Mol Pharm. 4 april 2022;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang et al. (2004) – “Detektion av integration av plasmid-DNA i värdens genomiska DNA efter intramuskulär injektion och elektroporation” (Gene Therapy, 2004). Hos möss injicerades naket plasmid-DNA intramuskulärt, följt av elektroporation för att förbättra upptaget. Med hjälp av en mycket känslig PCR på renat genomiskt DNA (med gelseparation för att avlägsna extrakromosomala former) identifierade författarna fyra oberoende integrationshändelser 4 veckor efter injektion. Förbindelsesekvensering bekräftade slumpmässiga integrationsställen (inga preferentella hotspots), vilket överensstämde med icke-homolog ändförening. Integrationsfrekvensen var låg men mätbar. Detta är en av de tydligaste demonstrationerna av faktiska spontana integrationshändelser in vivo för naket plasmid-DNA i muskler. Det är värt att notera att denna studie använde förbättrad DNA-leverans via elektroporation, vilket man kunde jämföra med den förbättrade leveransen via LNP.
Martin et al. (1999) – “Plasmid-DNA-malariavaccin: Potentialen för genomisk integration efter intramuskulär injektion” (Human Gene Therapy). Denna tidigare studie testade plasmid-DNA IM hos möss och använde Southern blot-hybridisering och PCR på högmolekylärt genomiskt DNA för att undersöka integrationen. Även om persistensen mestadels var extrakromosomal, rapporterade de bevis som tydde på sällsynt integration i vissa prover (dock inte lika definitivt sekvenserade som senare arbeten). Den satte ett riktmärke för låg risk men erkände potentialen för mycket lågfrekventa händelser, vilket påverkade FDA:s efterföljande riktlinjer för DNA-vacciner.
Ledwith et al. (2000) – ”Plasmid-DNA-vacciner: Undersökning av integration i värdens cellulära DNA efter intramuskulär injektion hos möss” (Intervirology). Naket plasmid-DNA injicerat intramuskulärt hos möss visade, och även om ingen detekterbar integration observerades, detekterades DNA fortfarande i quadricepsmuskeln upp till 26 veckor. DNA:t var extrakromosomalt.
7 WHO:s expertkommitté för biologisk standardisering, 74:e rapporten, bilaga 3. Utvärdering av kvaliteten, säkerheten och effekten av budbärar-RNA-vacciner för att förebygga infektionssjukdomar: regulatoriska överväganden https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
Dr. Charlotte Kuperwasser är en framstående professor vid institutionen för utvecklings-, molekylär- och kemisk biologi vid Tufts University School of Medicine och chef för Tufts Convergence Laboratory. Dr. Kuperwasser är internationellt erkänd för sin expertis inom bröstkörtelbiologi och bröstcancer samt förebyggande åtgärder. Hon är medlem i den rådgivande kommittén för immuniseringspraxis.
